雞卵泡顆粒細(xì)胞分離、培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟

　　雞卵泡顆粒細(xì)胞分離、培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟：
 

　　A. 翅下靜脈注射2mL EDTA-2Na(W/V，2%)溶液處死母雞，新潔爾滅消毒液浸泡消毒5min，打開腹腔，剪取整個(gè)卵巢，小心剝離卵泡(以8-15g為最佳)，置于裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿中；
 

　　B. 用加有雙抗的PBS緩沖液沖去血污，漂洗3次；將漂洗干凈的卵泡移入裝有預(yù)冷PBS緩沖液的平皿中，剝凈卵泡外膜、結(jié)締組織及血管網(wǎng)；
 

　　C. 用手術(shù)刀在卵泡表面劃一道1-2cm長(zhǎng)的切口(動(dòng)作要快)，釋放卵黃，用PBS緩沖液將剩余的卵黃液漂洗干凈，剩下的卵泡膜即為：基膜和卵泡顆粒細(xì)胞層；
 

　　D. 將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎，置于15mL離心管中，加4mL培養(yǎng)基，用1mL移液槍反復(fù)吹打1min，自然沉降5min，收集上清液備用；
 

　　E. 向離心管內(nèi)加入4mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀，置于37℃恒溫水浴鍋中消化30min，每5min震蕩一次；
 

　　F. 消化結(jié)束，加入4mL M199*培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化；用200目不銹鋼篩過濾，收集濾液，1200rpm離心5min；
 

　　G. 沉淀用M199洗2次，室溫離心，1200rpm，5min；棄上清，加入M199*培養(yǎng)基(含5%FBS及1%雙抗)重懸后接種于6孔塑料培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；12-24h后換液，隨后每天觀察，2-3天換液一次，待雞卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)融合用于實(shí)驗(yàn)。